1. MỞ ĐẦU
Cây Tông dù, còn gọi là cây Hương xuân, Mạy sao, Xoan hôi ... thuộc họ Xoan (Meliaceae), chi Hương xuân (Toona), là loài cây gỗ nhỡ đến lớn, có phân bố rất rộng tại nhiều nước trên thế giới (Ấn Độ, Trung Quốc, các nước Đông nam á …). Ở Việt Nam, Tông dù phân bố tại nhiều tỉnh miền núi phía Bắc và thường xuất hiện trên các vùng có độ cao từ 700 - 2.000m, thích hợp nhất là độ cao từ 900 - 1.200m. Tông dù là loài cây mọc nhanh, đa tác dụng, có chu kỳ kinh doanh ngắn, thích hợp cho việc gây trồng thuần loài (vì là cây ưa sáng hoàn toàn), cải tạo và làm giàu rừng tự nhiên, trồng phân tán xung quanh vườn hộ, trồng xen, che bóng trong các hệ thống nông - lâm kết hợp …; có thể trồng trên các đai cao, đặc biệt là các lập địa trên vùng núi đá vôi. Khai thác và phát triển nguồn gen cây Tông dù là một hướng đi rất cần thiết và có ý nghĩa thiết thực đối với sự nghiệp phát triển lâm nghiệp tại vùng cao của các tỉnh miền núi phía Bắc, Việt Nam (Võ Đại Hải, 2006).
Tính đa dạng di truyền là một chỉ số quan trọng đánh giá khả năng thích nghi và tồn tại của loài. Các nhà khoa học trong và ngoài nước đã thực hiện nhiều nghiên cứu về sinh lý, kỹ thuật canh tác, đặc điểm di truyền và bảo tồn tài nguyên của cây Tông dù. Nghiên cứu sử dụng công nghệ giải trình tự transcriptome đã xác định nhiều gen liên quan đến tổng hợp terpene, flavonoid và chuyển hóa anthocyanin (Lin N, 2018). Các nghiên cứu dựa trên dấu hiệu phân tử đã chỉ ra sự khác biệt đáng kể về đa dạng di truyền giữa các khu vực: sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu tài nguyên cây Tông dù ở Indonesia, cho thấy mức độ đa dạng di truyền ở mức trung bình (Jayusman, 2018); sử dụng dấu hiệu SSR phân tích 15 nguồn gen cây Tông dù hoang dã ở Tứ Xuyên phát hiện biến dị phong phú ở mức cá thể (YU Pengfei, 2019); nghiên cứu 5 quần thể trồng cây Tông dù tại Trung quốc, cho thấy mức độ phân hóa di truyền cao nhưng lưu thông gen giữa các quần thể thấp (Xing, 2016.).
Tuy nhiên, nghiên cứu về đa dạng di truyền của các quần thể cây Tông dù ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Đặc biệt, các nghiên cứu đa dạng di truyền của các cây trội được tuyển chọn làm nguồn giống hầu như chưa có. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc xác định những cây mẹ ưu trội thực sự về kiểu gen và những cây trội không có quan hệ gần gũi nhau về mặt di truyền để làm nguồn giống, tránh hiện tượng thoái hóa giống do sự giao phấn cận noãn.
Nghiên cứu này dựa trên dữ liệu giải trình tự transcriptome trước đó trên thế giới, sử dụng dấu hiệu phân tử SSR để phân tích tính đa dạng di truyền, sự phân hóa và cấu trúc di truyền của các quần thể cây Tông dù ở một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn được nguồn giống tốt để nhân giống phục vụ sản xuất; đồng thời giúp cho việc bố trí hợp lý giữa các gia đình cây trội trong xây dựng vườn giống, rừng giống sao cho khả năng thụ phấn chéo xảy ra một cách tối đa, góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lý nguồn gen cây Tông dù.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
50 mẫu lá cây Tông dù do Trung tâm Giống cây trồng, vật nuôi và thủy sản tỉnh Hòa Bình cung cấp. Mỗi mẫu lá được lấy từ một cá thể cây trội đã được lựa chọn và công nhận tại 4 tỉnh là Hòa Bình, Bắc Kạn, Cao Bằng và Lào Cai. Các mẫu được ký hiệu theo số hiệu cây trội và được bảo quản bằng silicagel trong túi nilon tới khi sử dụng. Thông tin các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong bảng 1.
Bảng 1. Thông tin về vật liệu nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
* Tách chiết DNA
Tách chiết ADN là một kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử, ADN tách chiết phải đáp ứng nhu cầu về số lượng, độ tinh sạch, mức độ nguyên vẹn tuỳ theo mục đích nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp CTAB (Doyle và Doyle, 1987) có một số cải tiến theo phương pháp Qiang Xu và cộng sự (2004) để tiến hành tách chiết ADN từ các mẫu nghiên cứu. Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được điện di trên gel agarose 0,8% và kiểm tra độ chính xác, độ tinh sạch được đo trên máy quang phổ Nanodrop.
* Phản ứng PCR-SSR
Tổng cộng 30 mồi SSR được sử dụng trong phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 15 ul. Mỗi phản ứng gồm 50 ng DNA, mỗi (1 uM), 100 mM mỗi loại dNTP, đệm PCR và 1 U enzym Taq polymerse. Phản ứng PCR được tiến hành trên máy PCR Master Cycler của Hãng Eppendorf với chu trình nhiệt: 94°C - 4 phút; 94°C - 1 phút; 55-60°C - 1 phút; 72°C- 2 phút, lặp lại 35 lần từ bước 2 đến bước 4; 72°C - 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% ở hiệu điện thế 70V, 60 phút trong dung dịch đệm TAE, được nhuộm trong Ethidium Bromid 5 ul (10 mg/ml) Sau đó sản phẩm PCR được kiểm tra dưới đèn UV, chụp ảnh và phân tích bằng Gel Doclt2 của Hãng UVP (Hoa Kỳ).
* Ghi nhận dữ liệu và phân tích thống kê
Phản ứng PCR được lặp lại 2 lần. Chỉ những băng rõ nét được ghi nhận kết quả. Các băng có mặt được ghi nhận (1) hoặc vắng mặt ghi nhận (0) đối với mỗi mồi trên cơ sở kích thước băng. Băng đa hình là băng không xuất hiện ở một trong số các mẫu. Băng đồng hình là băng có mặt ở tất cả các mẫu. Số liệu được sử dụng để tính hệ số tương đồng theo Nei & Li (1979). Phầm mềm STSYS 2.1 được sử dụng để phân tích hệ số di truyền, khoảng cách di truyền của các mẫu
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết ADN tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu, kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Ảnh điện di DNA tổng số đại diện của một số mẫu được thể hiện trong hình 1. Qua kết quả điện di cho thấy các băng DNA thu được của các mẫu Tông dù gọn và đồng đều, không bị lẫn tạp chất. Như vậy, cho thấy DNA có chất lượng tốt đủ tiêu chuẩn thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 50 cây Tông dù trên gel agarose 1% (các giếng từ 1 đến 50 là thứ tự của 50 cây Tông dù trong bảng 1)
3.2. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của nguồn gen của cây Tông dù
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 30 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 50 mẫu cây Tông dù (Bảng 1). Kết quả điện di thu được 13 cặp mồi cho kết quả đa hình và xuất hiện phân đoạn trên toàn bộ 50 mẫu Tông dù nghiên cứu. Sản phẩm PCR của 50 mẫu cây Tông dù với các chỉ thị SSR được điện di trên gel poly acrylamide 5% sau đó phân tích tính đa hình DNA dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn DNA khi so sánh giữa các cây với nhau.
Kết quả phân tích cho thấy, trong tổng số 13 cặp mồi cho kết quả đa hình giữa các mẫu nghiên cứu chúng ta có: Tổng số nhân bản được 42 phân đoạn DNA với kích thước dao động trong khoảng 80 - 450 bp, trong đó toàn bộ là các phân đoạn đa hình (chiếm 100%). Số phân đoạn DNA nhân bản được với mỗi chỉ thị dao động từ 2 (chỉ thị 14) đến 5 (chỉ thị 8).(Bảng 2)
Bảng 2: Tỉ lệ phân đoạn đa hình của 50 cây Tông dù phân tích với 13 chỉ thị SSR
Cây di truyền (dendrogram) thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Tông Dù được thu thập từ 4 tỉnh phía Bắc: Hòa Bình, Bắc Kạn, Cao Bằng, và Lào Cai. Dưới đây là phân tích chi tiết hơn về từng nhóm mẫu theo cấu trúc của cây di truyền.
Hình 2: Cây di truyền mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Tông Dù
Nhóm Hòa Bình (TDHB) gồm:
Các mẫu từ Hòa Bình gồm: TDHB 01, TDHB 03, TDHB 07, TDHB 11, TDHB 12, TDHB 15, TDHB 16.
- Trên cây di truyền: Các mẫu TDHB có xu hướng tập trung trong một vài nhóm gần nhau, cho thấy chúng có mức độ tương đồng di truyền cao.
- Mối quan hệ với nhóm khác: Một số mẫu TDHB có sự gần gũi với các mẫu từ Bắc Kạn (TDBK), đặc biệt là TDBK 03 và TDBK 16, cho thấy khả năng có chung nguồn gốc hoặc có sự giao thoa di truyền giữa hai khu vực.
Nhóm Bắc Kạn (TDBK) gồm:
Các mẫu từ Bắc Kạn gồm:
TDBK 02, TDBK 03, TDBK 08, TDBK 10, TDBK 11, TDBK 14, TDBK 16, TDBK 18, TDBK 19, TDBK 21, TDBK 23, TDBK 24, TDBK 25, TDBK 26, TDBK 29, TDBK 32.
- Trên cây di truyền:Nhóm TDBK có sự phân tán nhiều trên cây di truyền, chứng tỏ sự đa dạng di truyền lớn trong nội bộ tỉnh.
- Các mẫu gần nhau: Một số mẫu như TDBK 18, TDBK 19 nằm rất gần nhau, cho thấy có thể thuộc cùng một nhóm di truyền hoặc có quan hệ rất gần.
- Mối quan hệ với các tỉnh khác: Có một số mẫu TDBK 03, TDBK 16, TDBK 29 gần với các mẫu từ Hòa Bình, thể hiện khả năng di truyền chung.
Nhóm Cao Bằng (TDCB) gồm:
Các mẫu từ Cao Bằng gồm:
TDCB 03, TDCB 07, TDCB 08, TDCB 12, TDCB 13, TDCB 15, TDCB 16, TDCB 20, TDCB 23, TDCB 25, TDCB 27, TDCB 28.
- Trên cây di truyền:Nhóm TDCB cũng có một số cụm riêng biệt, nhưng không đồng nhất hoàn toàn.
- Mối quan hệ nội bộ: Một số mẫu như TDCB 07 và TDCB 08 có mối quan hệ gần gũi, chứng tỏ có thể cùng chung nguồn gốc.
- Liên kết với Bắc Kạn: Một số mẫu TDCB 16, TDCB 25 có sự liên hệ với nhóm Bắc Kạn (TDBK), có thể phản ánh sự giao lưu hoặc lai tạo tự nhiên.
Các mẫu từ Lào Cai (TDLCa) gồm:
TDLCa 01, TDLCa 02, TDLCa 05, TDLCa 06, TDLCa 08, TDLCa 10, TDLCa 12, TDLCa 14, TDLCa 17, TDLCa 19, TDLCa 26, TDLCa 28, TDLCa 29, TDLCa 35, TDLCa 36.
- Trên cây di truyền: Nhóm TDLCa có xu hướng phân tán trong các nhánh khác nhau, cho thấy sự đa dạng di truyền cao trong khu vực.
- Mối quan hệ nội bộ: Một số mẫu như TDLCa 05, TDLCa 06 nằm gần nhau, gợi ý chúng có thể có chung đặc điểm di truyền hoặc chung nguồn gốc.
- Liên kết với nhóm khác: Một số mẫu TDLCa 28, TDLCa 29 có mối liên hệ gần với nhóm Cao Bằng (TDCB), cho thấy khả năng có chung tổ tiên hoặc sự phân tán tự nhiên giữa hai khu vực.
Cây phân cấp (dendrogram) thể hiện mức độ tương đồng di truyền giữa các mẫu, dựa trên hệ số tương đồng (Coefficient) ở trục ngang. Các mẫu từ cùng một tỉnh có xu hướng được nhóm lại với nhau, nhưng cũng có sự pha trộn giữa các tỉnh, phản ánh mối quan hệ di truyền chặt chẽ giữa các địa phương lân cận. Hệ số trên trục ngang thể hiện mức độ tương đồng di truyền giữa các mẫu:
- Các nhánh có hệ số gần 1.0: Mẫu trong cùng nhóm có mức độ tương đồng di truyền cao, như TDHB 01 và TDHB 11, TDBK 18 và TDBK 19, hoặc TDLCa 05 và TDLCa 06.
- Những nhánh có hệ số thấp hơn: Một số mẫu dù cùng tỉnh nhưng có khoảng cách lớn hơn trên cây di truyền, cho thấy có sự khác biệt trong vốn gen, có thể do điều kiện sinh thái hoặc nguồn gốc khác nhau.
- Sự phân nhóm theo địa lý không hoàn toàn tách biệt, có những mẫu từ các tỉnh khác nhau nhưng có mối quan hệ di truyền gần gũi.
- Nhóm Bắc Kạn và Cao Bằng có sự pha trộn rõ rệt, chứng tỏ có sự giao lưu di truyền hoặc điều kiện sinh thái tương đồng giữa hai khu vực.
- Nhóm Lào Cai có mức độ phân hóa cao, điều này có thể do sự đa dạng về môi trường sống hoặc có nhiều quần thể khác nhau trong tỉnh.
4. KẾT LUẬN
- Mức độ đa dạng di truyền cao trong các mẫu cây Tông Dù từ 4 tỉnh.
- Có sự giao thoa di truyền giữa các tỉnh, đặc biệt là giữa Bắc Kạn và Cao Bằng.
- Các mẫu từ Lào Cai có sự phân hóa lớn, có thể do điều kiện địa lý và sinh thái khác nhau trong khu vực.
- Một số mẫu trong cùng tỉnh có mức độ tương đồng cao, cho thấy sự ổn định của một số quần thể địa phương.
Kết luận này cung cấp thông tin quan trọng về mức độ đa dạng di truyền và quan hệ giữa các quần thể, giúp định hướng cho công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Tông Dù tại Việt Nam.
Ghi chú: Đây là một phần kết quả nghiên cứu của nhiệm vụ quỹ gen cấp Quốc gia "Nghiên cứu khai thác và phát triển nguồn gen cây Tông dù (Toona sinensis (A. Juss) Roem) tại một số tỉnh miền núi phía Bắc", mã số 05/2023-HĐ-NVQG-ĐT do ThS. Nguyễn Văn Hùng chủ nhiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Doyle, J.J. and Doyle, J.L. (1987) A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochemical Bulletin, 19, 11-15.
Jayusman Jayusmam, Muhammad Na’iem, Sapto Indrioko, Eko Bhakti Hardiyanto, ILG Nurcahyaningsih; Assessment of genetic diversity among surian Toona sinensis Roem in progenies test using random amplified polymorphic DNA markers (2018) Indonesian a Journal of Biotechnology 22(1):22https://doi.org/10.22146/ijbiotech.25798
Lin N, Moore MJ, Deng T, Sun H, Yang LS, Sun YX, Wang HC. Complete plastome sequencing from Toona (Meliaceae) and phylogenomic analyses within Sapindales. Appl Plant Sci. 2018 Apr 27;6(4):e1040. doi: 10.1002/aps3.1040
Nei, M. and Li, W.H. (1979) Mathematical Model for Studying Genetic Variation in Terms of Restriction Endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76, 5269-5273. https://doi.org/10.1073/pnas.76.10.5269
Võ Đại Hải, Nguyễn Xuân Quát, Trần Văn Con, Đặng Thịnh Triều, 2006. Trồng rừng sản xuất vùng miền núi phía Bắc, từ nghiên cứu đến phát triển
Xing PY, Liu T, Song ZQ, Li XF. Genetic diversity of Toona sinensis Roem in China revealed by ISSR and SRAP markers. Genet Mol Res. 2016 Jul 29;15(3). doi: 10.4238/gmr.15038387. PMID: 27525892.
Xu, Q., Wen, X. & Deng, X. A simple protocol for isolating genomic DNA from chestnut rose (Rosa roxburghii tratt) for RFLP and PCR analyses. Plant Mol Biol Rep 22, 301–302 (2004). https://doi.org/10.1007/BF02773140
YU Pengfei，SUN Xiaojian，LI Chenchen，ZHANG Xu，ZHENG Wei，and LIU Changjin. Chromosome Karyotype Analysis and Development of SSR Molecular Markers in Toona sinensis[J]. ACTA HORTICULTURAE SINICA, 2019, 46(6): 1172-1182 DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0903.
SUMMARY
STUDY ON GENETIC DIVERSITY OF TOONA SINENSIS (A. JUSS) ROEM. IN SOME NORTHERN MOUNTAINOUS PROVINCES OF VIETNAM
Nguyen Van Hung1, Nguyen Thi Oanh1, Nguyen Viet Dung2, Đang Thi Nhan2, Tran Duy Cuong2, Tran Duy Duong2, Nguyen Truong Khoa2
1: Hoa Binh Center for Plant, Animal, and Aquatic Seed Production
2: Agricultural Genetics Institute
The Toona sinensis tree is a valuable timber species with high economic and ecological significance, suitable for afforestation, soil improvement, and natural forest enrichment. This study utilized SSR markers to assess the genetic diversity of 50 Toona sinensis samples. The results revealed a high level of genetic diversity among the populations, with 13 SSR primer pairs generating 42 polymorphic DNA fragments. The dendrogram indicated that samples from the same province tend to have close genetic relationships; however, there is also genetic exchange between populations, particularly between Bac Kan and Cao Bang. Meanwhile, samples from Lao Cai exhibited the highest level of genetic differentiation, reflecting differences in geographical and ecological conditions. The study’s findings are crucial for selecting high-quality seed sources, preventing inbreeding depression, and supporting the establishment of seed orchards for propagation. Additionally, this research provides a scientific basis for the conservation and development of Toona sinensis genetic resources, contributing to the sustainable development of Vietnam's forestry sector.
Nguyễn Văn Hùng - Trung tâm Giống cây trồng, vật nuôi và thủy sản Hòa Bình
Nguyễn Thị Oanh - Trung tâm Giống cây trồng, vật nuôi và thủy sản Hòa Bình
Nguyễn Viết Dũng - Viện Di truyền Nông nghiệp
Đặng Thị Nhẫn - Viện Di truyền Nông nghiệp
Trần Duy Cường - Viện Di truyền Nông nghiệp
Trần Duy Dương - Viện Di truyền Nông nghiệp
Nguyễn Trường Khoa - Viện Di truyền Nông nghiệp
